同种异体肌腱移植的免疫学研究进展

【摘要】  同种异体肌腱移植的结局与肌腱组织的免疫原性及组织学特异性密不可分。本文综述了同种异体肌腱移植的免疫学机制、肌腱的组织学特性、移植后腱细胞的转归、肌腱移植后的血管化以及二次消毒带来的问题。

【关键词】  同种异体肌腱；移植；免疫学

同种异体肌腱移植作为同种异体移植的一部分，其免疫学机制应遵循同种异体移植的免疫学机制。肌腱移植后也要经历针对移植物的细胞免疫和体液免疫。细胞免疫应答发生于急性反应的早期，在病变组织中常见以单核细胞为主的细胞浸润（其中主要是t细胞）。肌腱移植后，通过对移植物抗原的识别，受者cd4+t细胞被激活。活化的t细胞释放多种炎性因子（ifn-γ，il-2等），一方面直接引起迟发型超敏反应，另一方面可活化cd8+ctl，产生细胞毒效应。移植抗原特异性的活化cd4+th细胞可辅助b细胞分化成浆细胞，后者分泌针对同种异型组织抗原的特异性抗体。抗体可通过调理作用、免疫粘附、adcc和cdc的作用等途径对移植物造成损伤，引起排斥反应。在移植排斥反应中，体液免疫与细胞免疫协同发生作用，尤其是受者体内的预存抗体在超急性排斥反应中起重要作用。异体肌腱移植有自己的特点，效果优于其他组织器官移植，移植后免疫排斥反应弱，术后易于建立免疫耐受，且术后不需要使用免疫抑制剂。

1  同种异体肌腱移植的免疫学机制

　　1.1  同种异体肌腱的抗原性 

　　组成肌腱的腱细胞、基质、胶原成分，都能诱发免疫排斥反应，只是程度不同而已［1］。minami等［2］的研究发现，肌腱在去除胶原后，抗原性增加，认为胶原起到屏蔽作用而使肌腱的抗原性降低。肌腱的抗原性主要来源于腱细胞的糖蛋白，而这些糖蛋白受mhc基因控制。hla和mhc在细胞膜上表达强抗原性，但在基质和胶原内呈弱抗原性［3］。而pinkowski［4］认为抗原主要表现在基质，胶原的抗原性很弱。1981年minami做了两株纯系鼠异体肌腱移植实验，并通过补体依赖的细胞毒实验和吸收实验确定异体肌腱的抗原性主要存在于其腱细胞成分。文献报道［5］，未损伤的胶原不具抗原性，反之，经理化等手段处理后，胶原溶解，这种溶解状态的胶原有抗原性，由此推测：异体腱植入前的预处理，如消毒、冷冻，低温保护剂的使用等，可增添新的抗原。

　　1.2  同种异体肌腱移植的免疫学作用机制 

　　同种异体肌腱移植的免疫学作用机制应归属于同种异体移植的免疫学机制范畴。同种异体移植的单向作用机制指出［6］，体内存在：(1）宿主抗移植物反应（hvgr）：移植抗原可经直接递呈途径或间接递呈途径激发受者产生免疫反应。直接途径是移植物表面的异体mhc完整分子被t细胞直接识别，无须经过受者抗原递呈细胞（apc）处理。直接识别在排斥反应早期阶段起主要作用，可诱导强烈的排斥反应，带有异体抗原的细胞可直接诱发强烈的mcr和ctl。间接途径是供体抗原或脱落细胞被受体apc加工处理成多肽后被t细胞识别。间接识别在同种移植排斥反应早期即存在，但对较迟发生的排斥反应，特别是对慢性排斥反应起重要作用。供体mhc抗原释放后，被带到了淋巴结或脾脏被受者apc细胞递呈，间接激活th细胞，致敏t细胞浸润到移植物，并分泌淋巴因子（γ-干扰素），诱导移植物内皮和上皮细胞表达mhc ii类抗原，由受体apc递呈供体多肽激活的t细胞数量增多，浸润到移植物，并为激活ctl和b细胞产生特异性抗体起辅助作用。这种间接递呈作用对免疫反应起放大和维持作用，在较迟的排斥反应中可能起主要作用；(2）若植入含有大量免疫活性细胞的同种异体组织器官，在宿主免疫功能低下的情况下，无力排斥移植物，而移植物中的免疫活性细胞可被宿主的组织相容性抗原激活，继而导致针对宿主组织器官的免疫损伤，称移植物抗宿主反应（gvhr）。starzl［6］于1993年提出了“双向移植排斥模式”的假说：移植早期，移植物中的过路细胞一旦进入受者血循环即分布于全身，刺激受者免疫细胞，使之激活、增生，发生hvgr；另一方面，受者的白细胞也会进入移植物内，刺激移植物中的免疫细胞，使之激活、增生，发生gvhr。一般而言，除超急反应外，抗体在移植排斥反应中不起重要作用。1994年harner［8］等发现，在接受冷冻异体肌腱移植术后16个月，仍可检查出供体特异性组织相溶性抗体，主要是igg。1996年ritchie等［9］报道用冷冻肌腱重建膝交叉韧带的患者，45%的人可以查出特异性抗体，但其疗效并不差于未查出抗体的患者。

1.3  肌腱抗原性的处理 

　　1976年，friedlaende［10］在兔身上使用冻干异体骨移植，未发现明显排异反应，他认为深低温干燥方法处理的异体骨破坏或改变了细胞膜表面存在的hla抗原成分。1981年minami发现反复冻融和多聚甲醛处理的腱细胞抗原性明显降低。国内唐林俊与程国良［11］采用反复冻融，脱氧鸟苷培养，多聚甲醛处理、cm处理等方法处理异体肌腱并用于移植，取得了良好的效果。为降低肌腱的抗原性，国内外的学者，先后采用酒精浸泡、戊二醛浸泡、3%双氧水、0.3%洁尔灭、碘伏、丙酮、甲醇/氯仿、γ射线照射等多种方法处理异体肌腱。但经x线照射、丝裂霉素c、戊二醛处理可保留mhc抗原［5］。无论哪种保存方法，目的都是为了：(1）减少抗原性；(2）保持移植材料的完整性；(3）保证无菌。

　　目前冷冻处理能降低肌腱的免疫源性结论，已获得到国内外广泛共识。其机制是：冷冻处理改变或破坏了腱细胞表面的抗原结构，也杀死了对低温敏感的抗原呈递细胞，使其抗原性大大降低的同时，也使得免疫反应得以减弱。异体腱外膜，组织间质内的淋巴管，微血管内的树突状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞在冷冻处理过程被杀死或受损，这就意味着异体腱组织中不含apc。jackson［12］假设冷冻过程使细胞表面的特定蛋白变性，破坏了细胞膜，因此减弱了抗原性。guidos等［13］学者研究表明，主要组织相容性复合物，不是异体组织移植成功的首要障碍，mhc抗原需要抗原呈递细胞（apc）―通常是ⅰa阳性的巨噬细胞、树突状细胞和过路白细胞的辅佐，才能启动宿主对抗移植物的反应，而移植物所载的apc是触发排斥反应的首要因素。文献报道［14］，人和大鼠脾脏树突状细胞（dc）在冷冻速率提高时，存活率下降，在以20%/min速率降温时，存活率低于10%，在以70%/min速率降温时，冷冻后无活性树突状细胞存在。传统移植免疫学认为，dc是抗原提呈能力最强的apc，也是唯一能够激活初始型t细胞的apc。表达mhc ii类分子的dc使th细胞活化，激活移植排斥反应，这些dc可以是供者的dc，也可以是受者体内的dc。dc通过直接激活作用或间接激活作用，导致排斥反应发生。因此长期以来，去除移植物中的dc，减少移植的免疫原性，被认为是克服移植排斥反应最有效的方法。dc不仅在增强免疫反应上具有特别重要的作用，而且在诱导特异性的免疫耐受方面也具有十分重要的意义。在人的移植中，树突状细胞可能不太重要因为人的ⅱ类抗原主要表达在内皮细胞上［15］。

　　冷冻处理的肌腱基本被看作是一种极轻度或无免疫原性，使受体可以接受，而不易产生明显的排斥反应［1］。许多人认为轻度的免疫反应机体可以接受，不会产生明显的排斥反应，况且肌腱移植不同于器官移植，器官移植是功能性移植，出现排斥可导致移植失败，而肌腱移植的主要作用是提供一个生长支架。鲁晓波等［16］的实验发现，经冷冻/冻干处理能降低异体腱组织的抗原性，但仍可导致免疫排斥反应发生，异体腱的免疫排斥反应以受区局部组织为重，异体肌腱细胞的组织活性保存得越好，其抗原性则越强。

　　用细胞毒物质处理移植物，其目的是减少移植物的抗原性而不减弱其强度，细胞毒物质可以杀死细胞，使细胞膜破裂，因而破坏了移植物的抗原性，也减少了因冷冻处理抗原引起的移植物强度的下降。1975年urist［17］ 首先应用甲醇/氯仿（cm）浸出技术处理异体骨以降低其抗原性，tauro［18］等经过改进建立了处理牛肌腱的cm液，使免疫原性显著降低。pinkowski［4］体外实验发现：通过直接接触15% 3-硝基甲苯，5%β-聚维酮碘和h2o2，75%酒精能100%杀死成纤维细胞。用物理、化学方法消除肌腱组织的抗原性机制是：去除或灭活细胞成分及部分基质，细胞成分坏死残留的腔隙，会有利于周围成纤维细胞长入及胶原纤维的形成。但化学试剂残留可导致移植失败，辐射不存在残留的问题，但辐射可使髌腱力学性质产生不良影响，当合并冻干时更甚。

2  肌腱的组织学特点

　　肌腱组织是一种致密的结缔组织，由腱细胞、腱基质及胶原纤维束组成。腱细胞有分泌基质及胶原的功能。胶原量一般超过肌腱重量的75%，占干重量的99%，胶原是体现肌腱物物力学性能的主要物质［24］。这些胶原纤维按特定的方向和密度成组形成束，在外周纤维束呈螺旋状形式排列，而在中央呈纵形排列，在正常膝运动时，不同的张力下，有不同的长度，而不是平行排列的。自然状态下，前叉韧带的成纤维细胞被细胞外基质包绕、制约。前叉韧带的细胞散布于胶原纤维素间［19］。人类的前交叉韧带由两种直径的胶原纤维构成，单一直径的细胶原纤维(20～50nm)在胎儿的前交叉韧带才能见到。在成年人伴随年龄的增长，两种直径的胶原纤维出现了，大约有1/2的纤维直径在25～50nm，1/2的纤维在77～125nm。年龄大于65岁的老人，25～50nm 细胶原纤维占优势［7］。另外，肌腱组织缺少淋巴管和血管，组织结构致密，能限制抗原的渗出和抗体淋巴细胞的进入，因此免疫反应相对较弱［20］。异体肌腱移植不同于器官移植，肌腱移植属于非功能性移植，异体肌腱只为受区提供一个生长支架［1］。肌腱组织结构比较均一，功能单一，主要体现在生物力学上。

3  同种异体腱移植的排斥反应特点

　　1959年peacock［21］首次报告了新鲜异体肌腱移植，发生了明显的排斥反应和炎症反应。rodrigo报道［22］，未经处理异体腱植入宿主体内，局部表现为大量淋巴细胞浸润和细胞毒反应，这种反应在移植后的第2周达到高峰，腱组织为大量的淋巴细胞浸润，组织结构变性、坏死，结构消失，胶原纤维破坏，周围呈炎性改变，随后以细胞免疫为主的免疫排斥反应可持续存在2～3个月。而植入前经预处理的异体腱植入后，由于几乎无活细胞存在，抗原性大大降低。早期主要是炎性反应，后期以体液免疫为主，伴有大量细胞因子的释放，急性免疫反应很少发生。

4  腱细胞的转归问题

　　肌腱在移植后4～6周，异体与自体肌腱都表现出腱细胞的再聚集。1992年jackson等［23］，1985年amoeczky等［24］对兔的异体肌腱移植研究时发现，在移植腱坏死和塑型的同时，宿主的腱细胞迁移到植入腱的胶原纤维构架上，顺序是从外周到内部，并对供体腱内腱细胞的转归行pcr测定，结果发现在移植后第2周可以测出供体组织细胞呈阳性，但数量上明显减少，移植4周后，就不能测出供体细胞。这种供体腱细胞的衰亡起始于移植术后，最终胶原纤维架上的腱细胞均来自宿主细胞的迁移聚集。jackson［12］认为刚开始针对移植物的抗体缺乏可以说明这种随后细胞加速丢失的过程，他观察到迁移的细胞包括炎细胞、成纤维细胞和血管细胞。

5  移植腱的再血管化问题

　　同种异体肌腱移植和自体移植一样，要经历一个移植物坏死、细胞增殖、再血管化和胶原纤维塑形的过程［25］。异体肌腱移植的修复方式：高新生等［26］实验观察到肌腱移植后，大量新生成的纤维细胞、结缔组织细胞及毛细血管，沿两端肌腱表面及腱束浸入移植腱表面及周围组织，最终演变为排列整齐呈波浪型的胶原纤维束，使移植腱成为具有活细胞代谢功能的腱组织。jackson等［12］在山羊模型中看到了韧带血管化的过程中，韧带周围血管网横向与韧带内血管联系，在移植后6周，与自体移植相比较同种异体移植物鞘周显示血管化程度增加，且炎性反应增强，尽管两组(冻干，自体)在6个月时组织学变化相似，但电镜显示大量细胶原纤维存在于冻干组，提示胶原塑形延迟。shino［27］对人的同种异体移植的前交叉韧带活检研究发现，术后6个月原有的粗大胶原纤维完全就被细胶原纤维代替。

　　无论异体还是自体肌腱，在游离移植时都要经历1个再血管化的过程。jackson［23］在实验中发现异体肌腱在移植后第2周出现血管化征象，6～8周进入高峰，而在腱的中央部分血管化在相当一段时间呈低调。异体肌腱的完全血管化需30周，达到了正常水平需1年左右时间。horibe等［28］动物实验证实，移植后肌腱的再生血管和成纤维细胞均来自供体组织周围和缝合口两端，移植后2周内已开始有毛细血管长入，移植后6周时间质细胞开始浸润，移植腱中坏死的胶原组织被新生的成纤维细胞替代，异体腱的愈合时间比自体肌腱愈合时间长，植入的异体腱只起到生长支架作用。shino［27］认为深低温冷冻的肌腱重新血管化比冷冻干燥的快，原因是经深低温保存处理的腱组织中，有存活细胞存在，移植后借助周围组织液营养及两端血管的迅速长入，使存活细胞复苏增殖分裂，直接向纤维细胞，腱细胞转化，共同参与修复过程。冷冻干燥腱组织虽无活细胞，但具有某些活性蛋白物质，可能有诱导周围组织细胞增殖分化功能，并迅速使间充质细胞向腱细胞分化。深低温冷冻肌腱移植后，虽失去了代谢功能，但保持了肌腱的连续性，为肌腱的重新血管化和活细胞化提供了物质基础。临床研究显示肌腱同种异体移植物比自体移植愈合更慢，虽然愈合时间慢，但最终其功能与自体移植结果相似。shino［27］通过对人3～55个月肌腱移植物的活检发现，较多的细胞在移植后18个月才能看到。amoczky［24］观察到肌腱中心移植物坏死在术后4～8周，随后血管侵入，细胞增殖在3～4个月能观察到，再血管化过程完成需要6个月。

6  二次消毒带来的问题

　　rodrigo［22］在术前、术后测定人类33种白细胞抗原，结果在应用环氧乙烷消毒髌韧带的人术后，有1/3人出现了抗hla免疫反应，2/3病人存在着移植后松弛，慢性渗出。他用组织病理学检查了4个病人，3/4的病人对辣根过氧化酶反应呈阳性。他断定，一定是组织中改变的抗原性导致了免疫反应。他同时也注意到有1/4的病人组织病理测试，虽然为阳性，但随后的重建修复过程未发生针对hla的免疫反应。有文献报道［29］对膝关节交叉韧带重建的病人，从肿胀的关节腔内抽出含有淋巴细胞和中性粒细胞的渗液检验，确定是抗原引起了免疫反应，但不能确定为何种成分，有可能是细胞表面残余的抗原、胶原或基质成分。有文献［4］认为可能是环氧乙烷消毒过程中改变了软组织，使它作为一个半抗原诱发了免疫反应。用环氧乙烷消毒冻干的髌韧带重建交叉韧带，pinkowski等［4］发现体外用淋巴细胞转化试验50%病人发生了免疫反应。有文献［30］指出，eo及其残留是导致移植失败的主要原因，辐射灭菌不存在残留的问题，但辐射可使髌腱力学性质产生不良影响，当合并冻干时更甚。移植物的加工和2次消毒能潜在的改变移植物的相容性。jackson［12］通过对滑膜和移植物的气相色谱分析，发现了环氧乙烷代谢产生的有细胞毒性的氯化物，组织学和滑液的数据显示， 环氧乙烷的有毒代谢产物可导致移植物相容性变化，并且最终可导致移植物裂解。对于冷冻的骨韧带移植物加用聚维酮碘和过氧化氢处理，毫无疑问可以很大程度减少免疫反应，但同时也使移植物的最大负荷减少了15%［4］。

7  结束语

　　尽管同种异体肌腱移植临床上取得了良好的效果，但其免疫学机制仍不是十分清楚。jackson等［12］也提出免疫学因素尚未完全解决，经过处理的异体肌腱移植后的轻度排斥反应仍具有潜在危害性，依然是需要进一步研究、解决的问题。

【参考文献】略

注：本文摘自网络，如有不实，还请凉解。